背景及研究目的

目前肠道微生物群与肌炎及其相关间质性肺疾病（interstitial lung disease，ILD）的临床相关性以及肠道微生物群在该病中的致病作用尚不清楚 [1]。本研究的目的是通过宏基因组关联分析（metagenomic-wide association studies，MWAS）来探讨肠道微生物群在肌炎中的作用 [2]。

方法

我们采用全基因组鸟枪测序对中国肌炎患者肠道微生物组进行MWAS，包括30名肌炎患者和31名健康对照（healthy controls，HC）。在肌炎患者中，有11例患有快速进展性间质性肺疾病（rapidly progressive interstitial lung disease，RP-ILD），10例患有慢性间质性肺疾病（chronic ILD，C-ILD）。

主要结果

1. 来自拟杆菌门的多个菌种在肌炎患者的肠道微生物群中具有高丰度

我们分析了30例肌炎患者和31例健康人的肠道菌落的宏基因组。首先，选取平均相对丰度>1×10-3的细菌进行分析。基于Bray Curtis距离的主坐标分析表明，从β多样性的角度来看，肌炎患者和HC之间存在显著差异(Adonis P=0.001，图1A)。为了确定肌炎患者肠道微生物群的特征，我们随后比较了肌炎和HC中肠道菌群的总体分布(图1B)。并进一步绘制了差异火山图（图1C）。

2. 肌炎患者中dTDP-N-乙酰基甲胺生物合成途径相关基因富集上调

基于MetaCyc数据库(图2A)，我们通过HUMAnN2分析进一步确定了可能参与肌炎发病机制的生物学途径。结果表明，在参与dTDP-N-乙酰基甲胺生物合成的基因中，来自大肠杆菌的基因相对丰度最大，这表明大肠杆菌可能在dTDP-N-乙酰基甲胺的生物合成途径中发挥重要作用(图2B)。还有其他与dTDP-N-乙酰甲硫胺生物合成有关的细菌(图2B)。此外，在L-色氨酸生物合成、NAD生物合成I和L-精氨酸生物合成IV中，大肠杆菌的贡献也最大。这些结果提示，肠道大肠杆菌可能参与了肌炎的发病。

3.肠道菌群多样性与自身抗体水平和临床症状有关

抗PL-12抗体、抗Ro-52抗体或抗EJ抗体的存在与细菌多样性降低显著相关(Shannon-wiener多样性指数和CHO1丰富度估计值)，而抗PL-7抗体、抗SAE抗体和年龄与细菌多样性呈正相关(图2C-D)。R2越大，相关性越好，因此肌无力和类风湿因子（rheumatoid factors，RF）与细菌多样性的相关性比其他临床特征更显著(图2C-D)。结果显示肌炎患者和HC在肠道微生物组和相关的宏基因组生物学途径具有显著差异，揭示了肌炎可能的发病机制。

4. 肌炎患者RP-ILD组与C-ILD组的肠道微生物具有显著差异

为了探讨肌炎患者肠道微生物区系失调与ILD发生的关系，我们将肌炎患者分为三组：RP-ILD组、C-ILD组和非ILD组。β多样性分析显示，RP-ILD组与C-ILD组之间微生物区系多样性差异有统计学意义(P=0.029，图3A)，但ILD组与非ILD组之间差异无统计学意义。为了比较RP-ILD组和C-ILD组的微生物特征，我们还分析了两组细菌的总体分布水平（图3B）。然后，我们绘制了火山图，并注释了每一组的前五个富集群落（图3C）。

5. 甲基膦酸盐降解I相关基因主要参与肌炎RP-ILD的发病机制

基于MetaCyc数据库[17]，通过HUMAnN2进行功能分析，确定与RPILD相关的宏基因组生物学途径(图4A)。此外，还评价了微生物在这些途径中的贡献。分析表明，大肠杆菌对甲基膦酸解途径I、dTDP-N-乙酰基甲硫胺的生物合成、淀粉降解V等途径的贡献最大，这意味着大肠杆菌可能在甲基膦酸解途径I(图4B)、dTDP-N-乙酰甲胺的生物合成(图4C)和淀粉降解途径V(图4D)中发挥重要的作用。这些数据揭示了RP-ILD和C-ILD肌炎患者肠道微生物组和代谢组生物学途径的显著差异，提示不同的肠道微生物群可能参与了肌炎RP-ILD的发生发展。

6. 大肠杆菌与肠道罗斯拜瑞氏菌有助于诊断肌炎和RP-ILD

根据肠道菌群筛选的结果，我们进行了ROC分析，以评估其在肌炎组与对照组、RP-ILD组与C-ILD组两种情况下的诊断价值。我们选择了肠道微生物组中曲线下面积(area under curve，AUC)值较高的两种细菌——大肠杆菌和肠道罗斯拜瑞氏菌进行分析。我们发现大肠杆菌、肠道罗斯拜瑞氏菌以及大肠杆菌和肠道罗斯拜瑞氏菌的组合都具有很高的诊断价值。肌炎组与对照组相比，大肠杆菌、肠道罗斯拜瑞氏菌和两者组合的AUC值分别为0.705(95%CI，0.569~0.842)、0.860(95%CI，0.765~0.956)和0.867(95%CI，0.773~0.960)(图5A)。两者联合检测对肌炎患者的诊断价值最高。在RP-ILD组与C-ILD组中，大肠杆菌、肠道罗斯拜瑞氏菌和两者组合的AUC值分别为0.737(95%CI，0.508~0.967)、0.879(95%CI，0.725~1.000)和0.677(95%CI，0.428~0.926)(图5B)。肠道罗斯拜瑞氏菌对肌炎合并RP-ILD的诊断价值最高。这一结果表明，肠道罗斯拜瑞氏菌丰度的不同可以表征肌炎患者RP-ILD的发展。

结论

我们的MWAS研究首次揭示了肠道微生物群与肌炎发生机制之间的相关性，有助于我们了解肠道微生物群在肌炎和肌炎相关RP-ILD中的作用。

评论

肌炎是一组以肌肉炎症为特征的异质性自身免疫性疾病。通过对肌炎队列中患者的肠道微生物群进行MWAS分析，我们提出了肠道微生物群与肌炎或肌炎相关ILD之间的联系，并揭示了与该疾病相关的肠道微生物群影响的信号通路。以前关于肌炎肠道微生物MWAS分析的研究较少，此外，我们是第一个将肌炎RP-ILD和C-ILD的肠道微生物群进行MWAS分析的研究。这项研究存在一些局限性。首先，由于肌炎的发病率较低，本研究样本量较小。第二，肌炎有家族遗传倾向，但我们的研究没有纳入患者家属，这需要未来进行进一步的研究。第三，我们纳入的是未经过治疗的患者，排除了极端饮食和过去三个月服用抗生素的患者，但早期短期服用抗生素也可能会影响肠道菌群 [3]，未来研究应更详细的记录患者的用药和生活方式史。第四，我们探讨了炎症标志物如ESR、CRP、CK、肌炎联合自身抗体等与微生物群之间的关系。这些都是常用于诊断IIM和评估肌炎患者炎症状态的临床指标。但我们没有检测血浆中的促炎细胞因子、肠道通透性和微生物代谢物，需要未来进一步的检测。